基因治療是由含有工程化基因構(gòu)造的載體或遞送系統(tǒng)組成，其活性成分包括DNA或RNA，以及基因改造的病毒、細(xì)菌或細(xì)胞，通過(guò)將外源的基因?qū)�入靶�?xì)胞或者組織，進(jìn)行替代、補(bǔ)償、阻斷或者修正特定基因，達(dá)到治療疾病的目的。廣義上講，基因治療是在基因?qū)用娌僮鳎�以治療疾病的所有療法，主要分為體內(nèi)和體外兩種方式。

基因治療在后疫情時(shí)代飛速發(fā)展，其研發(fā)管線，在國(guó)內(nèi)和國(guó)際上都呈現(xiàn)飛速增長(zhǎng)的態(tài)勢(shì)，包括國(guó)內(nèi)外細(xì)胞基因治療（CGT）領(lǐng)域的投融資和BD合作。

質(zhì)粒DNA能夠廣泛用于基因細(xì)胞治療和核酸藥物領(lǐng)域。

如圖所示，質(zhì)粒包裹在宿主菌/大腸桿菌中，中間的一小部分就是質(zhì)粒DNA。

從結(jié)構(gòu)上看，質(zhì)粒是存在于細(xì)胞質(zhì)中的一類獨(dú)立于染色體的自主復(fù)制的遺傳成分。除了酵母的殺傷質(zhì)粒是RNA質(zhì)粒外，迄今為止所有的質(zhì)粒無(wú)一例外都是屬于這種類型的DNA分子。質(zhì)粒DNA分子可以持續(xù)穩(wěn)定地處于染色體外的游離狀態(tài)，隨著染色體的復(fù)制而復(fù)制，并通過(guò)細(xì)胞分裂傳遞到后代。

為了更好地適應(yīng)細(xì)胞的生理特點(diǎn)，質(zhì)粒主要以細(xì)長(zhǎng)并具有負(fù)超螺旋結(jié)構(gòu)的形式存在于原核細(xì)胞中。環(huán)形雙鏈的質(zhì)粒DNA分子具有三種不同的構(gòu)型：超螺旋質(zhì)粒DNA；開(kāi)環(huán)質(zhì)粒DNA和線性質(zhì)粒DNA分子。

質(zhì)粒DNA大部分都是雙鏈超螺旋的閉合環(huán)狀，少數(shù)是線性化的，且具有可轉(zhuǎn)移性、可整合性，以及拷貝數(shù)，后者分為松弛型和嚴(yán)緊型兩種狀態(tài)。

常見(jiàn)的質(zhì)粒工藝的主要流程包括載體構(gòu)建、發(fā)酵培養(yǎng)、堿裂解、澄清/濃縮、RNA層析、SC DNA層析、精純，以及濃縮置換。

載體構(gòu)建主要分為四部分：復(fù)制原點(diǎn)的選擇、抗性基因的選擇、調(diào)控序列的選擇以及目的基因的選擇。

首先是復(fù)制起點(diǎn)的選擇。為了提高質(zhì)粒DNA的產(chǎn)量，通常會(huì)選擇含Col EI復(fù)制原點(diǎn)的高拷貝質(zhì)粒。攜帶ColE1復(fù)制子的質(zhì)粒中，RNA II復(fù)制是正向的調(diào)節(jié)分子，RNA I是復(fù)制的負(fù)調(diào)節(jié)物。同時(shí)，質(zhì)粒編碼的一種Rop/Rom蛋白蛋白可以調(diào)節(jié)RNA I和RNA II的結(jié)合效率，起到增強(qiáng)RNA負(fù)調(diào)控的作用。我們發(fā)現(xiàn)，Rop/Rom基因缺失至少可使colE1質(zhì)粒拷貝數(shù)提高3至4倍。

其次是抗性基因的選擇。在選擇抗性基因時(shí)，由于極少量即可引起部分人群強(qiáng)烈的過(guò)敏反應(yīng)，首先應(yīng)避免β-內(nèi)酰胺類抗生素的使用。

在調(diào)控序列部分，構(gòu)建質(zhì)粒DNA需要考慮控制目的基因在真核細(xì)胞中高效和穩(wěn)定表達(dá)的啟動(dòng)子和終止信號(hào)等的調(diào)控序列。

最后是目的基因的選擇。在選擇和構(gòu)建質(zhì)粒DNA時(shí)，首先應(yīng)考慮的是質(zhì)粒DNA可否整合入宿主基因組，因此，在選擇目的基因時(shí)，須嚴(yán)格避免目的基因同人類基因組之間具有長(zhǎng)片斷的同源序列；啟動(dòng)子和終止子同樣須認(rèn)真篩選以嚴(yán)格控制其生物學(xué)活性。構(gòu)建質(zhì)粒DNA的過(guò)程必須有詳細(xì)的記錄，包括目的基因的序列，以及宿主菌的表型和基因型鑒定。

提高質(zhì)粒DNA穩(wěn)定性方法主要有四種，第一是改進(jìn)載體宿主系統(tǒng)，包括高表達(dá)和穩(wěn)定性。第二是施加選擇壓力，第三是控制外源基因過(guò)量表達(dá)，過(guò)量表達(dá)可能也會(huì)導(dǎo)致基因丟失和不穩(wěn)定。第四是優(yōu)化培養(yǎng)條件。

發(fā)酵主要是在培養(yǎng)基、培養(yǎng)方式、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、溶氧、pH、溫度、代謝產(chǎn)物這幾個(gè)方面進(jìn)行優(yōu)化。大腸桿菌可以在營(yíng)養(yǎng)豐富或貧乏的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，但是營(yíng)養(yǎng)物的種類及來(lái)源對(duì)質(zhì)粒DNA的質(zhì)量和數(shù)量都產(chǎn)生重大影響。

控制細(xì)菌較低的比生長(zhǎng)速率，對(duì)質(zhì)粒的復(fù)制有很大的好處，宿主菌過(guò)快的直接后果是質(zhì)粒復(fù)制跟不上細(xì)菌的生長(zhǎng)，導(dǎo)致拷貝數(shù)下降或者質(zhì)粒丟失。

質(zhì)粒工藝開(kāi)發(fā)最關(guān)鍵的工藝是裂解工藝，它利用溶胞后核酸從胞內(nèi)釋放，利用質(zhì)粒和染色體DNA變性和復(fù)性特點(diǎn)上的差異將質(zhì)粒和染色體DNA分離開(kāi)；在強(qiáng)堿性環(huán)境中氫鍵斷裂，DNA雙鏈解開(kāi)成單鏈變性，隨后用酸性緩沖液調(diào)至中性，變性質(zhì)粒迅速?gòu)?fù)性，溶解于溶液環(huán)境中，而染色體DNA不能迅速?gòu)?fù)性。

最經(jīng)典裂解工藝還是堿裂解。

溶液I中，EDTA是最重要的主成分，它可以螯合細(xì)胞膜和骨架上面的鈣離子、鎂離子，同時(shí)能夠使細(xì)胞更易破碎。EDTA在螯合鎂離子時(shí)，可以使內(nèi)源性的DNase因缺失鎂離子而無(wú)法發(fā)揮作用，同時(shí)保持DNA的穩(wěn)定性。

溶液I中會(huì)加入Tris溶液，后者主要起著緩沖pH值的作用，葡萄糖起著緩沖防止gDNA斷裂的作用。

溶液II是非常關(guān)鍵的一部分，它的作用主要是破裂整個(gè)細(xì)胞。SDS能夠破壞細(xì)胞膜，釋放菌體的內(nèi)容物。

與此同時(shí)，絕大多數(shù)蛋白質(zhì)和脂肪都在進(jìn)行變性的溶解。氫氧化鈉可以使DNA和基因組的DNA變性，而質(zhì)粒DNA由于特有的拓?fù)涑�螺旋結(jié)構(gòu)，在下一步自然的復(fù)性中能夠回復(fù)。而基因組的DNA卻永久變性。

溶液III是中和。整個(gè)溶液需要保持非常均勻的狀態(tài)，防止局部pH值過(guò)高，導(dǎo)致無(wú)法進(jìn)行DNA不可逆的回復(fù)作用。

正常情況下，裂解工藝中的裂解效率達(dá)到80％以上，后續(xù)才能夠得到比較好的結(jié)果。

這部分裂解的作用主要是質(zhì)粒的釋放和HCD的去除，是整個(gè)下游工藝回收和HCD控制最關(guān)鍵、最核心的步驟。但這部分存在裂解效率、HCD去除、工藝穩(wěn)定和放大可行性四個(gè)難點(diǎn)。

楷拓生物技術(shù)團(tuán)隊(duì)通過(guò)專有設(shè)計(jì)裝置實(shí)現(xiàn)可產(chǎn)業(yè)化放大的連續(xù)裂解工藝，并通過(guò)優(yōu)化稀釋倍數(shù)、裂解比例、裂解時(shí)間、中和時(shí)間等關(guān)鍵參數(shù)，可使連續(xù)裂解工藝的裂解效率穩(wěn)定在90％以上，HCD在粗純后控制在0.5％的水平，工藝穩(wěn)定，可行性放大。

TFF工藝切向流的應(yīng)用部分，包括菌體收集、裂解澄清，以及濃縮置換。目的是替換傳統(tǒng)的離心法和乙醇沉淀法。在大規(guī)模質(zhì)粒放大時(shí)，提高工藝可放大性和合規(guī)性。其中，材質(zhì)和孔徑、TMP優(yōu)化和剪切力是比較關(guān)鍵的地方，也是技術(shù)難點(diǎn)。

TFF工藝可選擇中空纖維膜柱和膜包，而質(zhì)粒工藝中選擇中空纖維膜柱效果會(huì)更好，因?yàn)橹锌绽w維的剪切力更小。

DNA層析主要分為分辨率、速度、載量，以及回收率四部分。

目前國(guó)內(nèi)也有在使用兩步層析法，其實(shí)就是用氯化鈣等層替代替了比較經(jīng)典的6FF工藝，原理基本是一樣的，主要目的還是去除RNA。

如圖所示，第一步Sepharose 6FF純化后，樣品中基本無(wú)RNA殘留。DNA超螺旋正常會(huì)在80％左右。第二步是Xtra，這一步最主要的作用是去除開(kāi)環(huán)的超螺旋。去除效率最高可達(dá)15％以上，純化后的超螺旋狀態(tài)一般會(huì)達(dá)到95％以上。最后一步主要是去除雜質(zhì)，比如HCD的殘留在這一步可以達(dá)到0.1％以下。

質(zhì)粒載體構(gòu)建和宿主菌的選擇，會(huì)對(duì)產(chǎn)率和質(zhì)量產(chǎn)生影響，對(duì)后期的生產(chǎn)工藝也會(huì)有很大影響，包括質(zhì)粒傳代的穩(wěn)定性、傳代穩(wěn)定性中不同的表達(dá)狀態(tài)，以及菌種的安全性，也就是明確不能使用氨芐青霉素抗性。

整個(gè)過(guò)程為：質(zhì)粒構(gòu)建—質(zhì)粒轉(zhuǎn)化—克隆篩選—RCB建庫(kù)—菌種培養(yǎng)—MCB建庫(kù)—菌種培養(yǎng)—WCB建庫(kù)—檢定放行。

其中菌種質(zhì)量的控制，主要是菌種特性、質(zhì)粒相關(guān)特性和質(zhì)粒鑒定三方面，不同的選擇在RCB、MCB和WCB中有一定差別。

當(dāng)前質(zhì)粒的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析方法主要有HPLC、CE、AGE法三種，其中AGE法應(yīng)用廣泛，但其存在一定弊端。而已公開(kāi)的HPLC和CE方法常見(jiàn)適用于5kb及以下小質(zhì)粒。

楷拓生物質(zhì)粒平臺(tái)已建立了適用于AAV及慢病毒包裝相關(guān)的7-12kb的質(zhì)粒的超螺旋比例HPLC檢測(cè)方法。平臺(tái)分析方法能對(duì)7-12kb質(zhì)粒的超螺旋、線性、開(kāi)環(huán)、聚集體峰進(jìn)行分離，如左、右圖示分為8kb、12kb質(zhì)粒圖譜。

線性化質(zhì)粒工藝開(kāi)發(fā)，其實(shí)就是在超螺旋的質(zhì)粒后加入酶切，再進(jìn)行純化和置換。線性化的質(zhì)粒分析就是比超螺旋質(zhì)粒更簡(jiǎn)單，基本上在酶促反應(yīng)之后，去除一些雜質(zhì)。一般線性化質(zhì)粒都可以達(dá)到98％或者99％以上的水準(zhǔn)。目前線性化DNA質(zhì)量的控制，也是分為研究級(jí)別、臨床GMP級(jí)別和GMP級(jí)別。

如圖所示，前面是在超螺旋狀態(tài)下檢測(cè)的峰型，后面是在酶促反應(yīng)線性化的情況。將線性化的4~8KBmRNA疫苗的線性化質(zhì)粒進(jìn)行重疊，會(huì)發(fā)現(xiàn)重疊性很高。

每個(gè)質(zhì)粒開(kāi)發(fā)的方法各不相同，不同的大小、不同的載體、不同的片段在工藝上的體現(xiàn)也是截然不同的。面對(duì)不同的需求，楷拓生物質(zhì)粒平臺(tái)可以針對(duì)每個(gè)質(zhì)粒的用途和特殊性去開(kāi)發(fā)專屬性的工藝，提供高效、靈活、可定制的專業(yè)服務(wù)。