如果把小分子藥物、抗體藥物稱為生物醫(yī)藥發(fā)展的兩塊里程碑，那基因治療則將是生物醫(yī)藥的第三塊跨時(shí)代的milestone。經(jīng)過(guò)多年來(lái)的技術(shù)發(fā)展與迭代，基因治療產(chǎn)業(yè)已經(jīng)逐步走向成熟，無(wú)論是衣殼、治療分子還是病毒的生產(chǎn)技術(shù)，都在不停的更新和發(fā)展。許多的基因治療公司也在這個(gè)時(shí)代的浪潮中，嶄露頭角。在這個(gè)專題中，小編會(huì)帶大家一起盤(pán)點(diǎn)下基因治療公司中的執(zhí)牛耳者，看看他們又怎么樣的技術(shù)優(yōu)勢(shì)與研發(fā)管線。上一期我們介紹了Spark Therapeutics，本期是我們專題中的第二篇，Asklepios BioPharmaceutical, Inc（AskBio）。

大約在 40 年前， Jude Samulski 博士首次克隆了腺相關(guān)病毒 (AAV)并將其應(yīng)用于疾病的治療，他開(kāi)創(chuàng)性的研究推動(dòng)了整個(gè)基因治療領(lǐng)域的蓬勃發(fā)展。在2001 年，Jude Samulski與他的學(xué)生也是肌營(yíng)養(yǎng)不良基因治療領(lǐng)域的著名專家Xiao Xiao博士以及具有豐富生物制藥公司領(lǐng)導(dǎo)經(jīng)驗(yàn)的Sheila Mikhail 博士共同創(chuàng)建了AskBio。在2001年左右，基因治療領(lǐng)域正經(jīng)歷著一個(gè)大低谷，FDA暫停了多項(xiàng)基因治療臨床試驗(yàn)。在大家都不看好基因治療的情況下，AskBio的生存環(huán)境十分艱難。在2004 年，肌肉萎縮癥協(xié)會(huì) (MDA) 同意向 AskBio 投資 160 萬(wàn)美元。這筆投資是MDA有史以來(lái)對(duì)企業(yè)進(jìn)行的最大和首次投資，也成為了AskBio早期杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥 (DMD) 研究的催化劑，孵化了現(xiàn)在臨床上很有前景的基因治療方法。隨著 2000 年代的第一個(gè)十年結(jié)束，世界開(kāi)始意識(shí)到基因治療的真正可能性。在接下來(lái)的20年，AskBio迎來(lái)了他蓬勃發(fā)展的時(shí)期。AskBio成立了多個(gè)專注于不同研發(fā)方向的子公司，包括專注于血友病藥物開(kāi)發(fā)的Chatham Therapeutics，專注于杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥藥物開(kāi)發(fā)的Bamboo Therapeutics等等。2020年，AskBio收購(gòu)了BrainVectis，豐富了其亨廷頓舞蹈癥和其他退行性疾病的治療研發(fā)管線。 同年，AskBio加入了拜耳公司，成為拜耳推進(jìn)細(xì)胞和基因療法在內(nèi)的新治療平臺(tái)的重要基石。

一． AskBio的基因治療研發(fā)管線

目前，AskBio在神經(jīng)肌肉、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心血管、代謝等疾病的方向上，有6項(xiàng)在研藥物。其中治療龐貝病 Pompe disease、帕金森氏癥Parkinson’s disease與充血性心力衰竭Congestive heart failure的藥物已經(jīng)進(jìn)入一/二期臨床，治療肢帶型肌營(yíng)養(yǎng)不良LGMD (2i/R9)、亨廷頓氏病Huntington’s disease與多系統(tǒng)萎縮Multiple system atrophy的藥物也已經(jīng)進(jìn)入到臨床前階段。其治療血友病藥物（武田于 2014 年收購(gòu)的 Chatham Therapeutics）和 Duchenne 肌營(yíng)養(yǎng)不良癥藥物（輝瑞公司于 2016 年收購(gòu)的 Bamboo Therapeutics）已經(jīng)簽署了licensed-out的許可協(xié)議。2015 年，AskBio 授予 AveXis 非獨(dú)占性的全球許可，允許在 Zolgensma ® 中使用其開(kāi)發(fā)的自我互補(bǔ) DNA 技術(shù)（scAAV）治療脊髓性肌萎縮癥（SMA）。

1. 龐貝病治療藥物ACTUS-101：

龐貝�。ㄌ窃�貯積病 II 型；酸性麥芽糖酶缺乏癥）是一種由橫紋肌和平滑肌中的酸性 α-葡萄糖苷酶 (GAA) 缺乏引起的破壞性肌病。它會(huì)引起糖原在溶酶體內(nèi)沉積，導(dǎo)致溶酶體增生、破壞，甚至釋放不正常的溶酶體酶而致一系列的血細(xì)胞遭到破壞。龐貝病主要影響肝臟、心臟和肌肉，并會(huì)導(dǎo)致肌肉無(wú)力和呼吸困難。盡管可以使用重組人 (rh) GAA 進(jìn)行酶替代療法 (ERT)，但是許多患者的預(yù)后很差。這主要是由于(rh) GAA的半衰期短，以及病人體內(nèi)顯著的抗 GAA 的抗體反應(yīng)所造成的。ERT 的局限性促進(jìn)了龐貝病基因療法的臨床前開(kāi)發(fā)。ACTUS-101通過(guò)單次靜脈注射穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)肝臟組織，并在肝臟中特異性持續(xù)表達(dá) GAA。GAA通過(guò)受體介導(dǎo)被細(xì)胞攝取，從而糾正了 GAA 的缺乏并清除了心臟和骨骼肌中積累的大部分的糖原。與ERT 的周期性、高水平GAA暴露不同，基因治療會(huì)使骨骼肌持續(xù)、低水平地暴露于來(lái)自肝臟的 GAA，這可以預(yù)防或抑制由ERT 治療后，抗 GAA 抗體形成所引起的并發(fā)癥。與肌肉靶向的龐貝病基因治療相比，肝長(zhǎng)效療法具有一定的優(yōu)勢(shì)，因?yàn)?AAV 載體對(duì)肝臟具有非常高的趨向性，這降低了龐貝病基因治療對(duì)AAV劑量的要求。ACTUS-101使用了AAV8的衣殼，并用肝特異性啟動(dòng)子LSP來(lái)驅(qū)動(dòng)GAA在肝臟內(nèi)的表達(dá)。目前階段的臨床試驗(yàn)，主要是評(píng)估 ACT-101 治療的安全性，以及評(píng)估這種治療對(duì)患者健康的影響，包括運(yùn)動(dòng)能力（6 分鐘步行）、肺功能的變化等等。

2. 帕金森病治療藥物AAV2-GDNF：

帕金森病是一種神經(jīng)性退行性疾病，是常見(jiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)病變之一。在帕金森病人中，大腦的黑質(zhì)區(qū)出現(xiàn)急劇功能退化，神經(jīng)元細(xì)胞死亡從而無(wú)法向相關(guān)腦區(qū)分泌多巴胺，從而最終導(dǎo)致病人運(yùn)動(dòng)遲緩、靜止性震顫、僵硬和姿勢(shì)不穩(wěn)定。GDNF 是一種天然存在于大腦中的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，它被發(fā)現(xiàn)能為可分泌多巴胺的神經(jīng)元細(xì)胞的生長(zhǎng)和存活提供支持。隨后的研究表明，GDNF 蛋白注射和GDNF基因治療能夠限制包括嚙齒動(dòng)物和非人類靈長(zhǎng)類動(dòng)物等多種帕金森動(dòng)物模型的神經(jīng)元功能障礙和退化。然而，神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)在人類神經(jīng)退行性疾�。ɡ�如帕金森�。┲杏虚L(zhǎng)期的營(yíng)養(yǎng)需求，因此需要持續(xù)供應(yīng)或頻繁施用營(yíng)養(yǎng)因子。GDNF基因治療可以在一次性給藥后持續(xù)產(chǎn)生和釋放 GDNF 蛋白，從而長(zhǎng)期緩解病人的癥狀。AskBio的AAV2-GDNF是利用野生型的AAV2衣殼包裹AAV基因組，ITR內(nèi)的GDNF會(huì)在CMV啟動(dòng)子的驅(qū)動(dòng)下進(jìn)行表達(dá)。AAV2-GDNF的大腦遞送是在術(shù)中 MRI 引導(dǎo)下使用定制的神經(jīng)外科方法和技術(shù)進(jìn)行的。手術(shù)期間腦部 MRI 將AAV2-GDNF 的分布實(shí)時(shí)可視化，并允許根據(jù)每個(gè)人的精確解剖要求定制治療劑的遞送方案。

3. 充血性心力衰竭治療藥物NAN-101：

充血性心力衰竭 (CHF) 是一種慢性疾病，病人的心臟無(wú)法為身體提供足夠的血液和氧氣。這個(gè)病癥可能是由心肌弱化、心肌僵硬或體內(nèi)組織對(duì)氧氣的需求增加，進(jìn)而超出心臟供應(yīng)能力的情況所引起的。充血性心力衰竭目前沒(méi)有可以治愈的方法，藥物和手術(shù)治療只能緩解癥狀并減緩進(jìn)一步的損害。研究表明蛋白磷酸酶抑制劑 1 (I-1c) 在衰竭的心臟中被下調(diào)，而使用基因療法表達(dá)具有活性的I-1c ，則有可能會(huì)改善心臟功能并為治療 CHF 帶來(lái)新希望。目前NAN-101已經(jīng)進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)階段，它是使用AAV 衣殼BNP116（AAV2i8）包裹著雙鏈的AAV基因組，并使用CMV啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)I1c基因的表達(dá)。

4. 多系統(tǒng)萎縮治療藥物AAV2-GDNF：

多系統(tǒng)萎縮 (MSA) 是一種罕見(jiàn)的神經(jīng)退行性疾病，在美國(guó)影響多達(dá) 17,000 人。目前尚未發(fā)現(xiàn)特定遺傳缺陷會(huì)直接導(dǎo)致這種疾病，因此它的發(fā)病原因很可能是遺傳因素和環(huán)境因素的共同作用。該疾病的臨床特征通常出現(xiàn)在 55 至 60 歲之間，60％ 的患者在 6 到 10 年內(nèi)從被確診進(jìn)展到死亡。該疾病的典型病癥包括血壓異常、尿失禁、帕金森綜合征、平衡不良、睡眠功能障礙、手臂和腿部不協(xié)調(diào)以及痙攣。MSA 的兩個(gè)主要亞型會(huì)表現(xiàn)出明顯的帕金森病 (MSA-P) ，或會(huì)出現(xiàn)小腦 (MSA-C) 萎縮癥狀，前者占所有病人總數(shù)的 60％。最近，科學(xué)家在MSA病人的大腦殼核區(qū)域中發(fā)現(xiàn) ，GDNF 和多巴胺的水平都有明顯降低，該區(qū)域在帕金森病中也顯示出明顯的多巴胺耗竭。 GDNF 基因療法旨在通過(guò)提高神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞系衍生神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子 (GDNF) 的表達(dá)水平，促進(jìn)易受傷害的腦細(xì)胞的存活和功能緩解病人MSA 的癥狀。AskBio對(duì)該病的治療藥物也是AAV2-GDNF。

二． AskBio的技術(shù)平臺(tái)

1. AAV衣殼開(kāi)發(fā)平臺(tái)：

雖然各種野生血清型的AAV一直能夠?yàn)榛�因治療提供良好的工具，但�?/span>AAV精準(zhǔn)的組織靶向?qū)τ谔岣?/span>AAV介導(dǎo)的治療效果有著重要的意義。因此AskBio建立了一個(gè)集生物信息學(xué)分析、晶體結(jié)構(gòu)分析、體內(nèi)/體外建模和基因組測(cè)序技術(shù)為一體的AAV衣殼開(kāi)發(fā)平臺(tái)。他們通過(guò)獨(dú)特的合理設(shè)計(jì)過(guò)程擴(kuò)展了天然血清型或者其他來(lái)源的AAV衣殼的能力，并可以優(yōu)化新的衣殼使其能夠逃避體內(nèi)抗體的中和反應(yīng)，以致最終可以應(yīng)用于單基因疾病、通路疾病、罕見(jiàn)病，以及一系列獲得性疾病。

（1）肝素和硫酸乙酰肝素結(jié)合嵌合載體

該嵌合衣殼家族包含修飾后的受體識(shí)別位點(diǎn)，可改變衣殼的細(xì)胞或組織趨向性，顯示可介導(dǎo)肺組織中靶細(xì)胞的修飾轉(zhuǎn)導(dǎo)。

（2）基于domain swap 的Loop嵌合載體

具有改造后Loop區(qū)域的嵌合衣殼在全身給藥后顯示出新的生物分布和轉(zhuǎn)導(dǎo)模式。例如，一些Loop區(qū)域改造后的嵌合衣殼不但可以在保持對(duì)其靶組織例如心臟、骨骼肌和腦組織的高水平趨向性 (AAV2i8-Asokan A. 2010 ; AAV2i8g9-Shen S. 2013)的同時(shí)，又可以使其在肝臟的脫靶水平減少到只有野生型母體的 1％-10％。這些Loop嵌合載體在針對(duì)心肌的臨床項(xiàng)目中有著非常廣闊的應(yīng)用前景。

（3）雙聚糖受體嵌合載體

除了證明病毒上聚糖受體足跡的模型之外，AskBio還為升級(jí)當(dāng)前用于臨床基因治療的 AAV 載體工具包提供了新的參數(shù)。利用這些參數(shù)進(jìn)行誘變和篩選，可以進(jìn)化出新的可以識(shí)別不同宿主聚糖的AAV 衣殼。例如雙聚糖結(jié)合 AAV，AskBio通過(guò)將 AAV 血清型 9 的半乳糖 (Gal) 結(jié)合足跡“嫁接”到可以結(jié)合硫酸乙酰肝素的 AAV 2骨架上 上，得到了一種雙聚糖結(jié)合 AAV 病毒株AAV2G9 ，這樣既可以利用 Gal 也可以利用 HS（Shen S.，2013）。與親本 AAV 血清型相比，AAV2G9 可以在體內(nèi)介導(dǎo)快速和持續(xù)、高效的轉(zhuǎn)基因表達(dá)。

2. 啟動(dòng)子開(kāi)發(fā)平臺(tái)：

AskBio 于 2019 年 8 月收購(gòu)了基因控制合成啟動(dòng)子技術(shù)的領(lǐng)導(dǎo)者 Synpromics Ltd，其專有的基于數(shù)據(jù)的啟動(dòng)子設(shè)計(jì)和生物信息學(xué)技術(shù)，為AskBio AAV 基因治療產(chǎn)品開(kāi)發(fā)提供了重要的支持。AskBio正在迅速地將 Synpromics AAV 啟動(dòng)子技術(shù)推向臨床，從而實(shí)現(xiàn)可誘導(dǎo)、可有組織靶向性地表達(dá)目的基因，并且增加目的RNA的穩(wěn)定性。據(jù)稱AskBio開(kāi)發(fā)出的表達(dá)原件有以下優(yōu)勢(shì)：在任何環(huán)境或生物條件下穩(wěn)定表達(dá)目的蛋白；表達(dá)原件里整合了所有需要的遺傳元件，包括 5’UTR、內(nèi)含子、cDNA 和 3 ’UTR；由于可以設(shè)計(jì)出較短的調(diào)控原件，因此其可以被整合到scAAV當(dāng)中；對(duì)細(xì)胞類型、發(fā)育階段或細(xì)胞狀態(tài)具有選擇性；可以將啟動(dòng)子原件設(shè)計(jì)為具有可調(diào)節(jié)、可誘導(dǎo)或可開(kāi)關(guān)的功能；針對(duì)整體尺寸進(jìn)行了優(yōu)化，降低了免疫原性，并減少了脫靶的副作用。

另外，AskBio也有著在生物信息學(xué)和機(jī)器學(xué)習(xí)方面的深厚積累。他們目前利用數(shù)據(jù)資源來(lái)深入了解基因調(diào)控，以準(zhǔn)確識(shí)別基因組中的新的調(diào)控序列并實(shí)現(xiàn)了一種獨(dú)特的啟動(dòng)子設(shè)計(jì)和構(gòu)建的方法。AskBio開(kāi)發(fā)的生物信息學(xué)引擎 PromPT™ 可為任何細(xì)胞類型或響應(yīng)任何環(huán)境、生物或化學(xué)刺激提供高效、有數(shù)據(jù)支持的啟動(dòng)子設(shè)計(jì)方案。

3. 高產(chǎn)的懸浮細(xì)胞生產(chǎn)線：

早在許多生物技術(shù)公司投身入 AAV 生產(chǎn)這一業(yè)務(wù)之前，AskBio認(rèn)識(shí)到一個(gè)AAV 基因治療行業(yè)的普遍需求——在AAV生產(chǎn)過(guò)程中提高產(chǎn)量和降低成本。2010 年，AskBio推出了 Pro10™，這是一種用于生產(chǎn)醫(yī)用AAV的大規(guī)模生產(chǎn)工藝。這個(gè)系統(tǒng)在無(wú)血清懸浮培養(yǎng)基中使用基于人胚胎腎 (HEK) 的細(xì)胞系，以業(yè)內(nèi)最高的規(guī)模和產(chǎn)量開(kāi)發(fā)和生產(chǎn) AAV 載體。Pro10™可以生產(chǎn)所有血清型和嵌合衣殼，并包裝單鏈和雙鏈AAV基因組，其受專利保護(hù)的細(xì)胞系在進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染時(shí)也有著明顯的成本優(yōu)勢(shì)。

4. dbDNA™開(kāi)發(fā)平臺(tái)：

目前AskBio正與其伙伴T(mén)ouchlight Genetics, Ltd.合作，將 Doggybone™ DNA (dbDNA™) 推進(jìn)到具有廣泛開(kāi)發(fā)和制造能力的臨床應(yīng)用階段。dbDNA™是一種純體外的DNA擴(kuò)增和純化技術(shù)。該方法的核心是利用兩種酶的活性：利用Phi29 DNA 聚合酶通過(guò)滾環(huán)擴(kuò)增來(lái)擴(kuò)增雙鏈 DNA，以及利用原核端粒酶生成共價(jià)閉合的線性 DNA，再加上簡(jiǎn)化的純化過(guò)程，產(chǎn)生只包含目標(biāo)序列的純 DNA 產(chǎn)品。該過(guò)程以環(huán)狀雙鏈 DNA 分子（通常為，質(zhì)粒）開(kāi)始，該DNA分子包含目標(biāo)序列，目標(biāo)序列兩側(cè)各有 56 bp 回文原核端粒酶識(shí)別序列。然后使該DNA分子變性并激活 Phi29 DNA 聚合酶。Phi29 啟動(dòng)該模板的滾環(huán)擴(kuò)增 (RCA)，創(chuàng)建原始構(gòu)建體的雙鏈串聯(lián)重復(fù)。接著添加原端粒酶，與目標(biāo)序列側(cè)翼的識(shí)別位點(diǎn)結(jié)合并進(jìn)行切割連接反應(yīng)，從而產(chǎn)生單體雙鏈、線性、共價(jià)閉合的 DNA 構(gòu)建體。然后添加一組常見(jiàn)的限制性內(nèi)切酶以切割不需要的骨架 DNA 序列，暴露出開(kāi)放式的 DNA，可以通過(guò)外切核酸酶消化去除這些 DNA。目標(biāo)dbDNA™ 可以從最終的反應(yīng)體系中純化出來(lái)。dbDNA™合成 DNA 不需要更大體積發(fā)酵菌體，這意味著AskBio可以在沒(méi)有細(xì)菌影響的情況下生成 DNA，與質(zhì)粒 DNA 相比，dbDNA™可以在更短的時(shí)間內(nèi)大量生產(chǎn)。更重要的是，AskBio可以在更大范圍內(nèi)組裝更安全的 DNA 序列，并具有與天然合成 DNA 相同的治療效果。