干預(yù)完成的細胞先用D-Hanks液將培養(yǎng)液沖洗干凈，以免影響熒光亮度，再用Rhodamine123（R-123；Molecular Probes，溶于DMSO）孵浴，終濃度10μg/ml，避光，37℃， 孵育30min；然后再用D-Hanks液將未被細胞吸收的R-123沖洗凈，就可以在激光共焦顯微鏡下檢測R-123熒光。R-123熒光用激光共焦顯微鏡（Leica SP-1 USA）在488nm時激發(fā)并且在530nm時檢測。

一、檢測原理：

羅丹明123（Rhodamine 123）是一種可透過細胞膜的陽離子熒光染料，是一種線粒體跨膜電位的指示劑。其在正常細胞中能夠依賴線粒體跨膜電位進入線粒體基質(zhì),熒光強度減弱或消失。而在凋亡發(fā)生時，線粒體膜完整性破壞，線粒體膜通透性轉(zhuǎn)運孔開放，引起線粒體跨膜電位(ΔΨm) 的崩潰, Rh123 重新釋放出線粒體, 從而發(fā)出強黃綠色熒光，可用熒光顯微鏡、熒光光度計或流式細胞儀檢測，通過熒光信號的強弱來檢測線粒體膜電位的變化和凋亡的發(fā)生，可用于培養(yǎng)的細胞或從組織中提取出的線粒體的膜電位檢測。

二、 使用方法：

1．細胞染色及分析

（1）培養(yǎng)細胞1×10⁶/mL重懸于培養(yǎng)基中；

（2）加入羅丹明123染液0.1μg/mL～50 μg/mL （根椐細胞種類不同而濃度不同，一般3～10 μg/mL）；

（3）37℃，5％ CO₂細胞培養(yǎng)箱孵育1～30 min（根椐細胞種類不同而不同，一般10 min）；

（4）離心以培養(yǎng)基洗細胞兩次；

（5）重懸細胞于培養(yǎng)基中，37℃，5％ CO₂培養(yǎng)60 min；

（6）流式細胞儀檢測：激發(fā)波長488～505nm，發(fā)射波長515～575 nm （一般為530nm）；

熒光顯微鏡觀察：滴加100 μL上述混合液于載玻片上，激發(fā)濾光片波長488nm，阻斷濾光片波長515nm觀察，拍照。

2． 組織提取的線粒體染色及分析

（1）按常規(guī)方法提取的線粒體，用適量的1×Assays Buffer（將5×Assays Buffer 用水稀釋5倍）重懸；

（2）常規(guī)方法進行蛋白含量測定后，用1×Assays Buffer調(diào)配成3mg/mL的線粒體溶液；

（3）取2mL 1×Assays Buffer和1mL線粒體溶液；

（4）加入適量待測化合物（同時設(shè)空白對照組），25⁰C保溫min；

（5）加入羅丹明123染液10 μL；

（6）熒光光度計檢測：上述混合液全部加入石英比色皿中，置于25⁰C下測定，激發(fā)波長488～505nm，發(fā)射波長530nm，連續(xù)記錄從0 min～30 min內(nèi)熒光強度的變化。

三、儲存 溶液置于－20⁰C，可保存一年。

細胞凋亡后用羅丹明123染線粒體跨膜電位，熒光強度是降低的. 羅丹明123是陽性染料，可以與具有高的負(fù)電性膜電位的線粒體所結(jié)合，當(dāng)?shù)蛲鰰r，去極化膜電位降低，故結(jié)合減少，所檢測到的熒光強度減弱

�；撬峤M線粒體膜電位均升高